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恒温快速扩增***盒常用酶原料

尿DNA糖基化酶尿DNA糖基化酶(UDG酶)又称尿-N-糖基化酶(UNG酶)，可水解含尿的单链和双链DNA释放出游离尿，而对RNA无活性，与dUTP搭配使用，可建立成PCR防污染体系。其原理如下：在PCR体系中将dTTP部分或全部替换为dUTP后，使得反应生成含有dU碱基的扩增产物，这些扩增产物不同于天然模板，在进入含有UDG酶的反应体系时，可被UDG酶识别并切割尿碱基与糖磷酸骨架间的N-糖基键，而经切割后的DNA链在碱性或高温条件下易于断裂降解，从而失去被当作模板再扩增的能力，因此可防止扩增子污染（如下图）。市面上的UDG酶主要有普通型和热敏型，其中热敏型UDG酶在室温条件下即可催化反应，50℃以上加热可使其灭活，防止其降解后续PCR形成的含dU扩增产物。虽然UDG/dUTP体系具有防污染功能，但在实际测试中还得兼顾PCR的效率和灵敏度。一方面需确保PCR扩增产物掺入足够量的尿碱基，从而可被UDG有效切割；另一方面也需要保证反应体系添加的dUTP不会明显影响PCR效率，因此dTTP和dUTP的佳比例需通过优化确定。

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TMA相关酶

依赖转录介导扩增(Transcription mediated amplification, TMA)的扩增模板为RNA或单链DNA，检测的扩增产物为RNA，详细原理可参考转录介导的核酸扩增技术小结。该体系所用酶有两种：M-MLV逆转录酶：用于模板RNA逆转录成DNA，并在逆转录过程中通过引物引入转录启动子序列，用于后续转录过程；T7 RNA聚合酶：以逆转录形成的DNA为模板，转录合成检测产物RNA。

恒温扩增***盒操作步骤

提前30分钟将***盒所需组分取出,室温融化。鹿荡混匀。

1).每个干粉反应管加入29.4 uL Abuffer (注意: Abuffer需完全融化混匀,否则会对实验效果产“生影响) ; 1.每个干粉反应管加入29.4 uLAbuffer (注意: Abuffer需完全融化混匀,否则会对实验效果产生影响) ;

2.每个反应管分别加入2 uL上游引物、2 uL下游引物和0.6 μ探针(引物和探针浓度为10 μM ,对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中)